La transferencia de un gen normal para suplir la función de uno patológico se conoce más popularmente como terapia génica, que es el nombre más extensamente usado para referirse a este proceso. Por extensión, la edición de un gen o su modulación por mecanismos genéticos también se denominan de manera general como terapia génica. ES importante destacar aquí que la transferencia de genes se refiere conceptualmente a que incorpora una versión de gen normal sin actuar sobre el gen mutado. Dado que el ADN es muy poco eficiente de llegar a las células y pasar al núcleo, la manera más eficiente de transferir un gen es a través de un vector. Existen vectores químicos, generalmente de estructura lipídica cargados positivamente que interactúan con la molécula de ADN cargada negativamente y que forman un complejo para transferir a células. Pueden albergar un ADN de gran tamaño y tienen muy baja inmunogenicidad. Este tipo de transportadores cada vez se están experimentando más para su uso en humanos para aumentar su eficiencia, versatilidad y expresión duradera. Por otro lado, están los vectores virales que tienen una gran eficiencia para transfectar las células y una expresión a largo plazo, aunque son potencialmente muy inmunogénicos y pueden ocasionar reacciones inflamatorias en ciertos órganos.

Habitualmente, un vector viral que albergue un gen tiene 3 componentes clave: un promotor, el gen en cuestión llamado (transgén) y una señal de terminación. También puede incluir señales de repetición invertidas o inverted terminal repeats (ITR), que contienen los orígenes de replicación para la síntesis de la copia de ácido nucleico. Los vectores virales son virus de origen natural que se han modificado, de modo que la mayoría de los genes virales originales se han reemplazado con otros genes para su funcionalidad específica. El gen incorporado tiene autonomía de replicación y regulación de acuerdo con la construcción genética. La eliminación en el vector de ciertos genes virales hace que se modifique la capacidad infectiva del mismo. Es decir, no se replica ni desencadena la misma respuesta inmune que el virus original de tipo salvaje. Existen 5 clases principales de vectores, como los retrovirus y lentivirus (que albergan hasta 8kb de transgén), el herpes virus (HSV-1, capaz de albergar de 40 hasta 150kb de material genético), los adenovirus (de 8 a 30kb) y los Adeno Associated Virus (AAV, que pueden albergar hasta un tamaño de 5kb). Los 2 primeros, retrovirus y lentivirus, se integran en el genoma y eso puede ocasionar disrupción del material genético del huésped, con el consiguiente perjuicio para el paciente. El HSV-1, el adenovirus y el AAV no se consideran integrativos y persisten en el núcleo celular como episomas extracromosómicos (fig. 2)11.

Figura 2.

Esquema del mecanismo de acción de la terapia génica del gen SMN1 por medio del AAV9. El vector es tomado por la célula por vía de un endosoma que luego se rompe al llegar al núcleo de la célula y libera el contenido. Nótese que el vector contiene el cADN del gen, es decir, solo los exones sin los intrones.

Los vectores AAV representan en estos momentos la plataforma líder para la transferencia de genes en el tratamiento de diversas enfermedades humanas. Se han mejorado muchos aspectos que le han hecho ganar popularidad y han contribuido sustancialmente al crecimiento del campo experimental y clínico de la terapia génica. Estos episomas tienen una replicación autónoma dentro del núcleo, aunque independiente del genoma del huésped. Administrados por vía intravenosa, se distribuyen por todas las células del organismo y generalmente atraviesan la barrera hematoencefálica (fig. 2).

El vector es tomado por la célula via endosoma, luego éste se rompe, llega al núcleo y ahí libera el contenido. Si la célula se replica, los episomas (habitualmente de 3 a 6 por célula) se repartirán como en un proceso de división celular. De esta forma el efecto se va diluyendo hasta que en sucesivas divisiones ya algunas células no lo recibirán. En cambio, incorporados a células que no se replican, por ejemplo, las neuronas, se mantienen durante un período prolongado de tiempo, aunque su funcionalidad a largo plazo no es posible asegurarla totalmente con la información actual que se dispone de investigación. Las dosis de genomas virales son variables, pero hay que tener en cuenta que se administran según el peso del paciente y que hay limitaciones de indicación si el paciente es mayor o adulto. Así se dosifican en genomas virales por kilogramo de peso en administración sistémica endovenosa como ocurre en la atrofia muscular espinal que se administran hasta 3×1014 genomas virales por kilogramo del paciente.

Desde el punto de vista de la respuesta inmune del huésped a la administración de vectores, por un lado, está la cuestión de la cantidad administrada que genera una primera respuesta del organismo y luego está la cuestión de si el huésped tiene anticuerpos neutralizantes pre-existentes por infecciones anteriores o en el caso de recién nacidos pueden haber recibido estos anticuerpos pasivamente de la madre. Todos estos factores pueden condicionar la efectividad de la terapia. Actualmente está aprobada por la agencia Food Drug Administration (FDA) y la European Medicine Agency (EMA) la terapia génica con AAV9-SMN1 (Zolgensma®) a menores de 2 años a los pacientes con atrofia muscular espinal y hay ensayos para su aplicación intratecal a los pacientes mayores12. Existen también varios ensayos clínicos utilizando vectores AAV en otras enfermedades neuromusculares y metabólicas, entre otras, que se pueden consultar en la página www.clinical trials.gov.

La terapia génica no está exenta de riesgos que se deben poner en balanza a la hora de definir la mejor opción terapéutica. Entre ellos la gravedad de la enfermedad, la disponibilidad de otras terapias y la edad del paciente. Ha habido casos de fallecimientos debido a efectos adversos fundamentalmente en relación a la dosis de vector y el daño hepático y vascular que se pueden presentar. Es así que varios ensayos pueden verse suspendidos cuando aparecen estas complicaciones. En cualquier caso, es importante estar bien informado y no crear expectativas no realistas a la hora de tomar la decisión por este tipo de tratamientos en pacientes con enfermedades genéticas graves13.

La edición génica se basa en la capacidad de realizar cambios muy específicos en la secuencia de ADN de un organismo vivo que queremos modificar porque está alterada. La edición de genes se realiza utilizando enzimas, particularmente nucleasas, que han sido diseñadas para unirse a una secuencia de ADN específica, capaces de producir cortes en las hebras de ADN, lo que permite la recombinación entre el ADN existente y el ADN de reemplazo que da como resultado la inserción de ADN de reemplazo. La clave para esta tecnología de edición de genes es una herramienta molecular conocida como Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats y Caspase 9 (CRISPR-Cas9)14.

A diferencia de la transferencia de un gen terapéutico donde el gen es una versión completa normal, en la edición génica el ADN del huésped que tiene la mutación o alteración es el que se modifica para que revierta o cambie su función.

La edición precisa de genes se está investigando en ensayos para el tratamiento de inmunoterapia contra el cáncer, infecciones virales y trastornos hereditarios hematológicos, metabólicos y oculares. Por el momento son investigaciones muy específicas que implican un cambio somático localizado y no su distribución generalizada en el organismo. Así es posible dirigirla al músculo esquelético cuyas características posmitóticas y multinucleadas permitiría la corrección de una subpoblación de núcleos que pudiera beneficiar a toda la miofibra. También se puede dirigir a retina e hígado. Dentro de las ventajas de esta tecnología se considera que es una herramienta versátil que permite llegar a cualquier secuencia específica y tipo celular; asimismo puede modificar cambios puntuales, deleciones, duplicaciones y podría potencialmente aplicarse a casi todas las enfermedades de base genética. Entre las desventajas se debe mencionar que algunos sistemas son poco eficientes; que pueden modificar células germinales con la consiguiente transmisión a otra generación en un futuro; que pueden insertarse en otras secuencias a las deseadas (off-target); que pueden generar mosaicismos genéticos (on-target) y que, en definitiva, sus efectos a largo plazo son desconocidos. No obstante, existen más de 80 ensayos clínicos activos utilizando tecnología CRISPR y casi todas las aplicaciones en ensayos clínicos actuales corresponden a patologías de órganos específicos o localizadas. Recientemente se ha aprobado CASGEVY, primera terapia para sickle cell disease y beta talasemia a un coste de aproximadamente 2 millones de euros por paciente. La misma implica que se deba hacer ex vivo, tratando células sanguíneas que se extraen del paciente y luego son reinyectadas. En enfermedades mitocondriales donde existe heteroplasmia, tanto la versión mutada como la sana están presentes en la misma célula y dependiendo de las copias alteradas, se puede manifestar la enfermedad. En este caso el ADN mitocondrial puede modificarse mediante la importación de nucleasas dirigidas a las mitocondrias que cortan y eliminan específicamente el ADN mt mutante, efecto observado tanto en células heteroplásmicas como en modelos animales.

Los editores de bases mediante transiciones precisas de C>T o A>G que transforman químicamente las bases se están utilizando actualmente en los experimentos y ensayos actuales de edición génica. Existe también una tercera generación de Caspasas por medio de la secuencia guía de ARN que corta una sola cadena (en vez de ambas como en la primera versión de CRISP-Cas9)16. Todas estas modificaciones intentan disminuir los riesgos y desventajas y aumentar su eficacia.

Como en el caso de la terapia génica de la atrofia muscular espinal, que se hace una inyección sistémica por vía endovenosa, los altísimos precios de todas estas terapias cuestionan su acceso para todo el colectivo de pacientes a su vez que implican aspectos discutibles sobre los beneficios económicos generados con estas terapias y el mantenimiento de los sistemas de financiación de salud15. La tabla 2 resume algunas de las terapias de alto coste actualmente aprobadas para su aplicación en humanos.

La epigenética es todo lo que cambia la expresión de un gen sin cambio en su secuencia. El ADN habitualmente incorpora grupos metilos para su inactivación y las histonas (proteínas que interaccionan con la cromatina) se desacetilan por lo que la maquinaria de replicación no puede tener acceso al molde para expresar el gen. Todo esto puede modificarse por agentes farmacológicos como los inhibidores de histona-deacetilasas o iHDAC, muy empleados en investigaciones y ensayos oncológicos, aunque en otras enfermedades parece todavía de aplicación más limitada. Un iHDAC conocido es el ácido valproico, antiepiléptico y además modificador del efecto de centenares de genes y que en el campo de la atrofia muscular espinal se ha utilizado en distintos ensayos dado su efecto in vitro e in vivo para aumentar la expresión del gen SMN y el aumento de ARN de SMN completo en los pacientes con AME. Los resultados de estos ensayos no han dado los efectos esperados17. Sin embargo, es posible que como terapia co-adyuvante de otras terapias modificadoras de la enfermedad puedan ser parte del arsenal terapéutico.

El pre-ARNm incluye los exones e intrones y es donde se realiza el proceso del splicing para separar los intrones y dejar los exones uno junto al otro para convertirse en el ARN mensajero maduro. Se sintetiza usando como molde la cadena antisentido del ADN. Recordemos que el ADN tiene doble cadena y va del extremo 5′ a 3′, la cadena sentido, y de 3′ a 5′, la cadena antisentido. La cadena sencilla del pre-ARNm usa el molde antisentido para generar una secuencia monocatenaria 5′ a 3′ que será la cadena sentido. El ARN maduro sale del núcleo hacia el citoplasma para que los ribosomas sinteticen el polipéptido correspondiente.

Aprovechando la cadena simple del pre-ARNm, los oligonucleótidos antisentido hibridan con partes complementarias del pre-ARNm. Estos oligonucleótidos son pequeñas moléculas de cadena única de entre 8 y 50 bases diseñados a partir de conocer la secuencia diana, que al hibridar con el pre-ARNm ejercen su efecto modulando el splicing, dado que forman un fragmento bicatenario en la parte específica.

Aunque no cruzan la barrera hematoencefálica, los oligonucleótidos antisentido logran una distribución generalizada en el sistema nervioso central (SNC) después de la inyección intratecal, siendo muy valiosos entonces como herramientas terapéuticas en enfermedades neuronales18.

Es importante señalar que, si la secuencia está dirigida al exón, este se excluirá del ARN maduro (salto del exón), como ocurre en el gen de la distrofina para la terapia de la distrofia muscular de Duchenne. En cambio, su hibridación a regiones intrónicas que son inhibidoras de la inclusión ayuda a la inclusión del exón. Aquí se introducen conceptos como el de exonic splicing enhancer (ESE) o exonic splicing silencer (ESS) o intronic splicing enhancer (ISE) o silencer (ISS). Este mecanismo de acción es la base del oligonucleótido nusinersen (Spinraza®), de 18 bases, que hibrida específicamente la región ISS1 del intrón 7 del gen SMN. Las proteínas inhibitorias del reconocimiento del exón 7 (hnRNPA1 y A2) son desplazadas, permitiendo la inclusión de este exón en el ARN maduro. La medicación fue aprobada en 2016 por la FDA y un año más tarde por la EMA para el tratamiento de todos los tipos de atrofia muscular espinal19.

Otra alternativa de tratamiento es el revertir o bloquear el efecto tóxico de un determinado ARN que resulte dañino para la célula. Por ejemplo, en la distrofia miotónica causada por la expansión de tripletes CTG (CUG en el ARN) en el gen DMPK. Luego de la transcripción, las repeticiones CUG expandidas en el ARNm de DMPK secuestran y dan como resultado la pérdida de función del factor de splicing MBNL1. La expansión CUG también conduce a la ganancia relativa de función de otro factor de splicing CUGBP1. El desequilibrio de MBNL1 y CUGBP1 da como resultado eventos de splicing alternativo desordenados que causan las alteraciones de la enfermedad. Las expansiones pueden bloquearse por agentes químicos como la pentamidina y es posible entonces restaurar el splicing alternativo normal al neutralizar el efecto de la expansión repetida CUG a través de la unión competitiva del agente químico por el factor de splicing20.

También es posible bloquear o degradar el ARN por medio del ARN de interferencia (ARNi). En este caso ya se ha producido el RNA maduro y se aprovecha un proceso natural en el que las moléculas de ARN bicatenario regulan la expresión de ARNm a través del emparejamiento de bases homólogas. Entra en juego una enzima Dicer que corta las moléculas largas de ARN bicatenario en varios ARN pequeños de interferencia. Una de las hebras del ARNi se ensambla en un complejo proteico denominado RISC (ARN-induced silencing complex) que identifica el ARNm en cuestión y lo corta degradándolo por la maquinaria celular. De esta manera se bloquea la expresión del gen. En humanos el ensayo clínico de AAV-ARNi para la enfermedad de Huntington (NCT04120493) se encuentra actualmente en la fase I/II y emplea el AAV5 para utilizar un microARN dirigido a la proteína huntingtina. Estos estudios seguramente proporcionarán datos importantes de seguridad y viabilidad para poder aplicar también otras enfermedades donde la expansión de tripletes o la toxicidad del ARN estén involucradas.

Las terapias de reemplazo, ya sea a nivel génico o de sus productos, son a primera vista las soluciones más simples y para algunos las más obvias, aunque, sin embargo, los mecanismos de reemplazo no son tan sencillos dado que hay que tener en cuenta muchos factores entre ellos su peso molecular, la vía de administración, la absorción por los tejidos y la vida media y metabolismo de estas proteínas administradas de manera externa. La síntesis de proteínas actualmente se realiza en general artificialmente (son proteínas recombinantes) dados los peligros de transmisiones de agentes patógenos cuando provienen de otras fuentes. En algunas proteínas es muy difícil que puedan llegar al órgano o célula diana y su administración sistémica puede tener problemas por el peso molecular de algunas de ellas.

La traducción del ARN a proteína en los ribosomas tiene 3 procesos: la iniciación, la elongación y la terminación. Con frecuencia en las enfermedades neuromusculares hay mutaciones que cambian el aminoácido por un codón de parada. Estos codones de terminación prematuros hacen que la proteína no se sintetice por completo y sea truncada con una rápida degradación. Inclusive muchas veces el ARN que lleva la información del codón stop se degrada sin llegar a traducirse. Podemos modificar el reconocimiento de los codones de terminación prematuros con compuestos como los aminoglucósidos, el PTC 124 y, más recientemente, Elox. Se han probado para modificar el efecto de las mutaciones stop al incorporar otro aminoácido en lugar del codón de terminación. El ARN de transferencia que lleva el aminoácido puede introducir en la cadena polipeptídica no específicamente el mismo aminoácido de la proteína normal, sino que, en muchas circunstancias, transforma una proteína mutada stop truncada en una completa, pero esta proteína tendrá un cambio de aminoácido como si fuera mutación missense o de cambio de sentido. Así, en el PTC 124 se ha observado que generalmente si el codón stop es UAA o UAG, conduce a la incorporación de aminoácidos específicos como Gln, Lys y Tyr y en el codón UGA serían Trp, Arg y Cys21.

Una vez sintetizada la proteína (si es que el mecanismo de enfermedad permite la síntesis de una proteína mutada diferente a la normal), el procesamiento postraduccional implica el transporte de la proteína a la membrana, la formación de un complejo con otras proteínas, su actuación como catalizadora de una reacción o su función dentro de una determinada vía metabólica. Para realizar algunas de estas funciones y darle mayor o menor estabilidad, la proteína puede tener plegamientos, señalizaciones, y se pueden ampliar las posibles funciones de la proteína al unirle otro grupo químico funcional, como acetatos, azúcares (glicosilación), para su marcación o reconocimiento o fosforilación, y puentes de azufre para cambio de forma. Finalmente, la proteína se metaboliza y degrada por distintos mecanismos a través del lisosoma, las ubiquitinas o el proteosoma. En este sentido existen medicaciones que afectan a las modificaciones químicas o la degradación de proteínas que sean de interés, siendo un campo de estudio muy prometedor22. Como se mencionó anteriormente, la página ClinicalTrials.gov es una base de datos de estudios clínicos financiados con fondos públicos y privados de ensayos clínicos realizados en todo el mundo donde es posible consultar todas las medicaciones de este tipo que se están investigando en humanos.